О ЛАЛ-тесте
Для контроля качества инъекционных лекарств необходимо проверять в них уровень пирогенных примесей. Традиционно наличие или соответственно отсутствие в критически-значимых концентрациях таких примесей в инъекционных препаратах определялось на кроликах. Величина повышения температуры тела у животных на протяжении 3-5 часов служило показателем наличия или отсутствия пирогенных примесей в испытуемом препарате. Само собой разумеется что такой способ тестирования лекарств довольно затратен и не отличается гуманностью к животным.
Более 20 лет назад был предложен альтернативный метод определения наличия в лекарствах пирогенных примесей. Дело в том что наиболее часто пирогенными примесями в лекарственных препаратах являются бактериальные эндотоксины – фрагменты внешней оболочки грам-отрицательных бактерий. В основе нового метода лежал процесс физико-химического взаимодействия эндотоксинов с лизатом клеток крови (амебоцитов) мечехвостов, в результате которого происходит образование геля различной плотности. Поскольку первые исследования проводились на мечехвостах Limulus polyphemus, то реактив, приготовленный из их крови, был назван Limulus Amebocyte Lysate, или сокращенно ЛАЛ-реактив, а сам метод получил название ЛАЛ-тест. В 1980 году этот тест был впервые включен в Фармакопею США, а начиная с 1983 года он получил признание во многих странах Европы.
О методе
ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.
Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.
ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.
О методе
ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.
Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.
ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.
Методы обнаружения бактериальных эндотоксинов в фармацевтических препаратах и имплантируемых медицинских изделиях
Бактериальные эндотоксиныявляются ключевым вопросом безопасности и качества в фармацевтической и медицинской промышленности. Важность бактериальных эндотоксинов заключается в том, что они относятся к пирогенам. К пирогенам относятся разнообразные группы соединений, определяемые их способностью вызывать быстрое повышение температуры тела при их введении в кровоток («Pyro» происходит от греческого слова, обозначающего огонь).
Термин бактериальные эндотоксины является практически синонимом липополисахариду (ЛПС/LPS), который является основным компонентом наружного слоя клеточной стенки у грамотрицательных бактерий. Грамотрицательная клеточная стенка более сложна, чем у грамположительных бактерий, и имеет внешнюю мембрану или оболочку, состоящую из ЛПС. Она действует как барьер проницаемости для клетки и также важнадляформирования биопленок и улавливания макромолекул из окружающей среды.
При грамотрицательном бактериальном сепсисе высвобождение пирогенных ЛПС вызывает выделение большого количества воспалительных цитокинов, что может привести к токсическому шоку. Грамотрицательные бактерии постоянно синтезируют ЛПС, чтобы заменить потери с поверхности клетки, и когда клетки умирают, они высвобождают ЛПС из клеточной стенки. Это означает, что свободные ЛПС всегда будут присутствовать в среде, содержащей грамотрицательные виды. Грамположительные бактерии, напротив, не выделяют внеклеточные ЛПС.
Поэтому важно контролировать рост грамотрицательных видов в воде, в других сырьевых материалах и в производственной среде, чтобы предотвратить производство пирогенов. Однако отсутствие грамотрицательных бактерий не означает отсутствия пирогенов. ЛПС является очень стабильным веществом и не разрушается нагреванием или другими средствами. Он может сохраняться очень долго в жидкостях и на сухих поверхностях при отсутствии жизнеспособных бактерий. Это значит, что тесты, специально разработанные для выявления эндотоксина/ЛПС, необходимы для демонстрации безопасности фармацевтических и медицинских изделий.
Метод обнаружения
Первым методом, широко используемым для обнаружения эндотоксина в фармацевтических препаратах, был пирогенныйтест на кролике, первоначально описанный в 1925 году. Этот метод включает в себя инъекции кроликам тестируемой жидкости, а затем наблюдение за ними на предмет любого повышения температуры тела и симптомов лихорадки. Данный метод используется при определении пирогенности, согласно ГОСТ ISO 10993-11-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 11. Исследования общетоксического действия» и ОФС.1.2.4.0005.15 «Пирогенность». Пирогенный тест на кролике является одновременно трудоемким и дорогостоящим для выполнения и не может быть количественным. Его применение также ограничено продуктами, которые не вызывают побочных эффектов у подопытных животных. Этот тест по-прежнему одобрен в качестве метода обнаружения пирогенов, но в настоящее время используется редко, поскольку он был в значительной степени заменен лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus Amebocyte Lysate) или LAL-тестом.
LAL-Тест
LAL-тест берет свое начало в открытии 50-х годов прошлого века, демонстрирующим, что кровь Атлантического мечехвоста (Limulus polyphemus) образует сгустки в присутствии бактериального эндотоксина. Позже было установлено, что эта реакция вызвана фактором свертывания, содержащимся в гранулах подвижных клеток крови, называемых амебоцитами. Фактор свертывания высвобождается в кровь из клеткив качестве защиты от инфекции, когда обнаруживается эндотоксин. Наличие даже очень низких уровней бактериального эндотоксина запускает «коагуляционный каскад» реакций, включающий ряд ферментов сериновой протеазы и приводящий к образованию тромба (сгустка)коагулинового геля. Эта реакция была превращена в чувствительный тест на эндотоксин путем сбора амебоцитов из крови мечехвостов и последующего лизирования клеток с получением реагента, содержащего фактор свертывания – лизатамебоцитов мечехвоста.
Были разработаны три основных LAL-метода: гель-тромб, хромогенный и турбидиметрический. Метод гель-тромб может быть положен в основу очень простого метода детектирования путем добавления реагента к образцу в пробирке и инкубации при 37°C в течение одного часа. Если тромб (сгусток) виден при инверсии трубки, то результат положительный. Это метод конечной точки, и его можно сделать полуколичественным путем тестирования последовательных разведений. Результаты выражаются в единицах эндотоксина (EU), что является мерой эффективности эндотоксина, а не его количества. Это отражает вариабельность токсичности природных ЛПС. Хромогенный метод использует синтетический субстрат, который меняет цвет, когда он расщепляется эндотоксин-активированной протеазой, в то время как турбидиметрический метод опирается на развивающийся сгусток коагулинового геля, изменяющий мутность образца. Оба метода могут быть использованы в качестве количественных кинетических методов путем построения стандартных кривых времени начала воздействия на концентрацию эндотоксина. Спектрофотометрические приборы могут обнаруживать изменения мутности или цвета при гораздо более низких концентрациях эндотоксина, чем те, которые необходимы для образования видимого тромба (сгустка) геля, что делает хромогенные и турбидиметрические методы гораздо более чувствительными, чем метод геля-тромб. Чувствительность определяется самой низкой концентрацией на стандартной кривой.
LAL-тест в настоящее время является стандартным методом тестирования бактериальных эндотоксинов парентеральных лекарственных препаратов и медицинских изделий и определяется как гармонизированный метод в фармакопеях США, Европы, Японии и России (USP chapter 85, EP 2.6.14 Supplement 6.6, JP General Test 4.01, ОФС.1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины»). Можно использовать любой из трех методов, но эталонным методом в случае возникновения каких-либо споров является предельный тест геля-тромб. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) также опубликовало детальное руководство по тестированию бактериальных эндотоксинов и пирогенов для фармацевтической и медицинской промышленности в 2012 году.
Оно включает в себя информацию о планах отбора проб, хранении образцов, валидации альтернативных тестов на бактериальные эндотоксины и предпочтительном использовании количественных тестов в программах качества по дизайну (QBD). При проведении тестирования на бактериальные эндотоксины необходимо учитывать ряд важных моментов. Один из них заключается в том, чтобы обеспечить использование во время тестирования лабораторного оборудования и реагентов без пирогенов для избегания ложноположительных результатов. Медицинские изделия обычно проверяются путем промывки поверхности стандартным объемом специально подготовленной апирогенной воды или подходящим растворителем. Ряд факторов может помешать проведению теста, воздействуя либо на бактериальный эндотоксин, либо на LAL-реагент. Примеры включают рН, концентрацию белка и наличие примесей химических веществ в парентеральных препаратах или в их смывах. Интерференция может привести к неспособности обнаружить бактериальные эндотоксины, и поэтому очень важно его идентифицировать. Лучше всего это сделать с помощью образцов положительного контроля, в которые добавлен подходящий эталонный стандарт бактериального эндотоксина или сертифицированный стандарт.
Существует широкий спектр коммерческих тестовых продуктов, основанных на LAL-методологии, которые ориентированы на удобство и простоту использования. Реактивы для гель-тромб, хромогенных и турбидиметрических испытаний – все они доступны, оптимизированы для конкретного метода и поставляются в лиофилизированной форме с подложками и буферами, готовыми к восстановлению перед использованием. Реагенты выпускаются в количествах, пригодных для одиночных испытаний, для многократных испытаний или навалом для лабораторий, работающих с большим количеством образцов.
Простые тесты на тромб геля могут быть проведены с минимальным оборудованием, в то время как кинетические тесты, по крайней мере, требуют спектрофотометра. Многие коммерческие реагенты теперь предназначены для использования в формате микропланшетов. Степень автоматизации может быть достигнута с помощью считывателей инкубационных пластин, оснащенных программным обеспечением, предназначенным для проведения анализа бактериальных эндотоксинов, таким как Endoscan-V ™ от Charles River.
Экспресс LAL-методы
Альтернативы LAL-тесту
Хотя LAL-тест остается стандартным методом для тестирования бактериальных эндотоксинов, существуют опасения по поводу некоторых аспектов этого метода, которые привели к разработке альтернатив. Например, коммерческие партии лизата могут отличаться по своей чувствительности к бактериальным эндотоксинам, а также по своей специфичности. Но потенциально более серьезной проблемой является сокращение запасов мечехвостов. В то время как кровь этих существ может быть собрана без ущерба для животного, другие экологические нагрузки приводят к тому, что дикая популяция становится под угрозой исчезновения. Отсутствие необходимости собирать их кровь для производства LAL, безусловно, поможет в их сохранении. Многое уже было достигнуто за счет сокращения количества LAL-реагента, необходимого для проведения анализов, но методология все еще опирается на достаточный запас мечехвостов и в конечном счете может оказаться неустойчивой.
Еще одним альтернативным методом является тест на активацию моноцитов (monocyte-activation testing/MAT), который использует иммунную реакцию, обнаруженную в крови человека. Тест использует моноциты, которые активируются пирогенами, чтобы произвести воспалительный цитокин интерлейкин-1β (IL-1β), который затем может быть обнаружен с помощью анализа ELISA. Этот метод не является специфичным для бактериальных эндотоксинов, но также обнаруживает другие пирогены и одобрен EP в качестве альтернативы in vitro теста на пироген кролика. Это говорит, что он является лучшим индикатором реакции лихорадки человека на пирогены, чем LAL-тест, потому что он основан на иммунном ответе человека. MAT-тест был реализован в коммерческих продуктах, таких как система Pyro Detect, поставляемая компанией Merck Millipore.
Термины и определения
ЛАЛ-реактив
Биохимический реактив, получаемый из лизированных амебоцитов (клеток крови) мечехвостов вида Limulus Polyphemus. Обладает высокой чувствительностью к бактериальным эндотоксинам и используется для определения их содержания в лекарственных препаратах и активных фармацевтических субстанциях.
Чувствительность ЛАЛ-реактива (λ)
Обозначается греческой буквой λ. Выражена в единицах эндотоксина на миллилитр, ЕЭ/мл и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом (в гель-тромб тесте), или соответствует точке с минимальным значением на стандартной кривой (в фотометрических методах анализа).
Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ)
Очищенный липополисахарид, полученный из штамма E. Coli. Активность контрольного стандарта эндотоксина установлена по международному стандарту эндотоксина. Используется для подтверждения заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива и для постановки контролей. Активность контрольного стандарта выражается в Единицах эндотоксина (ЕЭ).
Бактериальные эндотоксины
Фрагменты клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Представляют собой сложные липополисахаридные комплексы. При попадании в организм человека через парентеральный путь введения вызывают пирогенный ответ (повышение температуры тела). Так как грамотрицательные бактерии вездесущи по своей природе, бактериальные эндотоксины могут попадать в лекарственные препараты в процессе их производства из фармацевтических субстанций, лабораторной посуды, воды, производственного оборудования.
Вода для ЛАЛ-теста
Для приготовления растворов ЛАЛ-реактива, контрольного стандарта эндотоксина и разведений испытуемого лекарственного препарата используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте.
Гель-тромб тест
Метод проведения ЛАЛ-теста, в котором результаты анализа определяются визуально. Анализ проводят в стеклянных пробирках размером 10х75 мм, в которых смешиваются равные части ЛАЛ-реактива и испытуемого препарата. Пробирки с реакционной смесью инкубируют в водяной бане или термоблоке при температуре 37°С ± 1 °С в течение одного часа. По истечении времени инкубирования результаты определяются визуально: если в пробирках образовался плотный гель, который не стекает при однократном переворачивании пробирки на 180О, то результат засчитывается как положительный. Если в пробирке остался раствор или образовался гель, который стекает при переворачивании пробирки, то результат реакции считается отрицательным. Гель-тромб тест – это самый простой метод проведения ЛАЛ-теста, который не требует приобретения дорогостоящего оборудования. Освоение ЛАЛ-теста проще всего начинать именно с этого метода.
Качественный гель-тромб тест (метод А)
Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье. В качественном гель-тромб тесте испытуемый препарат проверяется в двух повторностях в одном выбранном разведении. Если в этом разведении получены положительные результаты, то содержание эндотоксинов в данном препарате более или равно фактору этого разведения, умноженному на чувствительность используемого ЛАЛ-реактива.
Количественный гель-тромб тест (метод В)
Этим методом определяют содержание бактериальных эндотоксинов с помощью ряда последовательных разведений испытуемого лекарственного средства. В анализ ставится серия последовательных двукратных разведений препарата, не менее четырех разведений. Положительный контроль испытуемого препарата (контроль ингибирования) ставится для наименьшего разведения испытуемого препарата, так как ингибирование прямо зависит от концентрации испытуемого препарата в растворе. В анализе определяется конечная точка реакции для каждой повторности. Конечная точка реакции – это наименьшее разведение для каждой повторности, в которой еще происходит образование геля. Концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом препарате для каждой повторности рассчитывается как произведение фактора разведения для конечной точки реакции на чувствительность ЛАЛ-реактива. Далее рассчитывается среднее геометрическое значение для всех повторностей, как в опыте «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива».
Если для всех разведений испытуемого препарата получены отрицательные результаты, то содержание бактериальных эндотоксинов будет менее значения фактора разведения наименьшего разведения, умноженного на чувствительность ЛАЛ-реактива.
Если для всех разведений испытуемого препарата получены положительные результаты, то содержание бактериальных эндотоксинов будет более или равно значению фактора разведения наибольшего разведения, умноженного на чувствительность ЛАЛ-реактива.
Предельное содержание бактериальных эндотоксинов
Допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в фармакопейной статье. Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу:
Предельное содержание бактериальных эндотоксинов = К / М, где:
К — пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 час для испытуемого лекарственного препарата (если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального). При интратекальном пути введения лекарственного препарата К составляет 0,2 ЕЭ/кг;
М — максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного часа (выражается в мг, мл или ЕД на 1 кг массы тела).
Максимально допустимое разведение препарата (МДР)
Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства. МДР – это такое разведение испытуемого препарата, в котором можно сделать однозначный вывод о соответствии/несоответствии лекарственного препарата требованию раздела «Бактериальные эндотоксины».
Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле:
где:
«предельное содержание бактериальных эндотоксинов» — допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в фармакопейной статье;
«концентрация испытуемого раствора» — концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов
λ — чувствительность ЛАЛ-реактива, в ЕЭ/мл.
Положительный контроль испытуемого препарата
Представляет собой испытуемый препарат в выбранном разведении, к которому добавлен эндотоксин в концентрации, в два раза превышающей чувствительность используемого ЛАЛ-реактива (то есть, 2 λ). Данный контроль должен быть положительным и позволяет удостовериться в том, что испытуемый препарат в выбранном разведении не ингибирует реакцию гелеобразования.
Положительный контроль опыта
Представляет собой воду для ЛАЛ-теста, к которой добавлен эндотоксин в концентрации, в два раза превышающей чувствительность используемого ЛАЛ-реактива (то есть, 2 λ). Данный контроль должен быть положительным и позволяет удостовериться в том, что ЛАЛ-реактив и контрольный стандарт эндотоксина не потеряли своих свойств в процессе транспортировки и хранения.
Отрицательный контроль опыта
Представляет собой воду для ЛАЛ-теста. Данный контроль должен быть отрицательным и позволяет удостовериться в том, что все используемые в опыте материалы не содержат бактериальные эндотоксины в определяемых в тесте количествах.
Ничего не найдено 🙁 Попробуйте ввести, к примеру, лал-реактив
